光學顯微鏡使用可見光進行照明,用光學透鏡進行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相機進行觀察.基本的明場照明顯微鏡由光源、目鏡、物鏡、載物臺、聚光鏡、光圈等部件組成.收到衍射效應的限制光學顯微鏡的分辨率極限, 其中聚光鏡NA 是數(shù)值孔徑(Numerical Aperture)為物鏡與樣品間介質(zhì)折射率以及孔徑角正弦值的乘積是光學顯微鏡重要的參數(shù)之一.阿貝極限將光學顯微鏡的分辨率限制在約200納米處. 為了提高顯微鏡的成像素質(zhì),擴展應用范圍,光學顯微鏡經(jīng)過不斷的發(fā)展改進,已經(jīng)成為現(xiàn)在產(chǎn)品品質(zhì)保證必要一種光學設備.

光學顯微鏡的成像手段:

普通寬場成像 (Wide field) :光學顯微鏡基本的成像光路全內(nèi)反射熒光(TIRF):利用光在介質(zhì)界面發(fā)生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只對樣品表面200nm 左右深度內(nèi)進行成像,隔絕來自焦外光線的干擾.

共聚焦(Confocal):利用空間針孔對焦外光線進行隔絕,對樣品進行逐點掃描成像,大大提高z軸分辨率..

多光子(Multi-Photon):利用長波長的光波繞射能力強,穿透能力高的特性,讓熒光分子同時吸收多個長波長光子激發(fā)短波長熒光,從而實現(xiàn)使用較低能量的光照來對厚樣品成像.目前成像的深度已經(jīng)達到毫米級別.

光片 (Light sheet):對垂直于物鏡光軸的切片進行照明,避免了對焦外部分樣品的照明,大大提高z軸分辨率,同時相對 confocal 成像速度更高.

結(jié)構(gòu)光 (Structured light):將照明光進行正弦調(diào)制或其它形式的調(diào)制形成結(jié)構(gòu)光照明,與樣品表面形成摩爾紋,使得一部分高頻信息能夠被觀察到.這種方法高能夠提升兩倍的分辨率,屬于一種超分辨技術(shù).

受激發(fā)射損耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):熒光顯微鏡中激發(fā)光由于衍射效應,在樣品上形成的是一個亮斑,亮斑內(nèi)的熒光分子均被激發(fā)產(chǎn)生熒光,STED在激發(fā)光上嵌套一個環(huán)形光,使對應環(huán)形區(qū)域的分子發(fā)生受激輻射而不產(chǎn)生熒光,只有中心區(qū)域分子產(chǎn)生熒光,從而突破衍射極限限制的分辨率.STED的分辨率可以達到30nm左右.

  隨機光學重構(gòu) (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):隨機激發(fā)單個熒光分子,對其光斑進行擬合得到中心分子的位置,不斷隨機激發(fā)分子并將得到的圖案疊加,得到超越衍射極限分辨率的圖像,STORM的分辨率可以達到20nm左右.